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親和層析原理：親和層析是應用生物高分子物質能與相應專一配基分子可逆結合的原理，將配基通過共價鍵牢固地結合于固相載體上制得親和吸附系統(tǒng)。伴有雜…
親和層析是應用生物高分子物質能與相應專一配基分子可逆結合的原理，將配基通過共價鍵牢固地結合于固相載體上制得親和吸附系統(tǒng)。伴有雜質的高分子分離目的物在一定條件下,能以某種次級鍵與已固定化的配基結合，而雜質則不被吸附。分去雜質后更換條件，又可使高分子物質重新解離，因而獲得純化。
親和層析更適用于從某些組織勻漿或發(fā)酵液中，分離相對含量低、雜質與純化目的物之間的溶解度、分子大小,電荷分布等物化性質差異較小,其它經(jīng)典手段分離有困難的高分子物質。因親和層析專一性高,操作簡便，時間短，得率高,故對分離某些不穩(wěn)定的高分子物質，更具優(yōu)越性。
下圖中圓球表示載體,球上黑色箭頭表示配基。當各種不同功能的高分子物質(分別以方塊、半圓和三角缺口來表示配基結合部位)通過時,只有帶三角缺口的高分于物質能與固相上的配基專一結合，其它高分子物質則不受阻礙地流出，然后改變洗脫條件使分離目的物解離而洗脫下來。
(3)有稀松的網(wǎng)狀結構使大分子能自由進入。
(4)有較好的化學穩(wěn)定性，能經(jīng)受親和層析時所用條件
(6)對酶及微生物侵蝕穩(wěn)定，價格合理。
2，蛋白純化親和層析載體簡介
玻璃對酸堿、有機溶劑及生物侵蝕非常穩(wěn)定，并且本身義特別堅硬,易于化學鍵合連接分子臂,是一極為理想的載體。但由于價格昂貴,而且有時呈現(xiàn)SiOH基的非特異性吸附，這是最大的缺點。由于其應用上具極大優(yōu)點，克服缺點方面的研究正在進行中
丙烯酰胺和 N,N-甲叉雙丙烯酰胺的共聚物是一種良好的載體。具有三向網(wǎng)狀結構和碳氫骨架面，它的大量酰胺基支鏈非但使凝膠具有親水性，且可供活化。但在配基偶聯(lián)后網(wǎng)塊縮小不利于親和層析是其缺點。
多糖類載體目前應用最廣，纖維素是其中最經(jīng)濟的一種可作為固相載體的物質。但纖維素作為親和層析載體尚有許多缺點，首先活化后會產生帶電荷的離子而物理結構又較緊密。雖然較小的配基能引入纖維素，但是蛋白和核酸的通透性則受空間位阻所阻礙。因此高度取代的配基并不能保證高容量的吸附，特別是配基和吸附物都是蛋白時更是如此。
葡聚糖凝膠是用環(huán)氣氯丙烷作為交聯(lián)劑，把多聚葡萄糖交聯(lián)而成的珠狀凝膠。其化學性能及物理穩(wěn)定性都比較好,但多孔性能較差。最松散的結構如Sephadex G-200，也只能讓分子量6X105的球蛋白通過。在配基偶聯(lián)上去后，凝膠膨脹度將進一步縮減，故其應用范圍和纖維素載體相同，都有一定的局限性。葡聚糖凝膠只適合與小配基制成親水吸附劑以及免疫吸附系統(tǒng)，由于用在這方面容量和通透性的要求都不高，一般較常用。(5)瓊脂糖凝膠和交聯(lián)瓊脂糖凝膠載體
瓊脂糖凝膠是由D-半乳糖和3,6-脫水-半乳糖相間結合的鏈狀多糖。它高度親水，具有極松散網(wǎng)狀結構,可以讓上百萬分子量的大分子通過。物理和化學性能都比較穩(wěn)定。通過溴化氰及環(huán)氧乙烷類試劑活化,引入活性基團,并在極溫和條件下連接上較多配基,吸附量較大。在非專一吸附方面，如果緩沖液離子濃度不太高，它對蛋白質幾平?jīng)]有吸附作用，在室溫用1mol/L的強酸或強堿處理2~3h不會引起顆粒性質的變化。用較濃的尿素或鹽酸胍長期處理，亦不引起吸附性能的減弱，即使用蛋白變性劑徹底洗脫大分子物質亦不致引起破壞，這就保證了吸附劑可以反復使用。珠狀瓊脂糖凝膠的缺點是它不能象葡聚糖凝膠一樣進行干燥和凍干，且經(jīng)不起有機溶劑處理，因為有機溶劑處理可引起珠狀凝膠嚴重不可逆碎裂。因此人們就用類似葡聚糖凝膠的交聯(lián)方法發(fā)展出另一更為理想的交聯(lián)瓊脂糖凝膠，它具有上述凝膠的優(yōu)點面減少其缺點。
三，親和吸附和洗脫
純化蛋白質的親和層析基本用柱法。在上柱時應選擇配基和目的物之間作用最強的離子強度和pH組成,使最有利于形成親和絡合物，一般則選取中性pH作為吸附條件。樣品應溶于親和層析柱的平衡緩沖液中,或用平衡緩沖液進行透析。上柱速度盡可能慢，對溫度不敏感的物質，室溫純化即可；對溫度敏感的物質，可以采用在4℃下純化，通常的親和層析圖譜如下圖。
樣品上柱后分離目的物先緊密地吸附在親和柱上,用平衡緩沖液洗滌時層析譜上出現(xiàn)第一個雜蛋白的峰。繼續(xù)用大量平衡緩沖液充分洗滌，必要時用不同緩沖液洗滌以除去非專一吸附的雜質,使柱上只留下專一吸附的目的物。然后改變緩沖液，要求選擇能減弱純化目的物與親和吸附劑之間吸附力的條件,使絡合物解離洗出，圖譜上出現(xiàn)第二個峰。一般洗脫方法是改變緩沖液的pH，改變離子強度或同時改變兩者。洗脫蛋白質大多數(shù)用0.1mol/L稀醋酸或0.01mol/L稀鹽酸，如果目的物會被酸破壞，可使用0.1mol/L氫氧化銨洗脫。蛋白質洗出后應立刻中和、稀釋透析、重折疊為天然結構恢復蛋白質活性。
除改變緩沖液pH作為洗脫方法以外，尚有用可溶性配基作競爭性洗脫。例如用較高濃度的抑制劑、輔酶或底物,競爭洗脫酶。用各種糖或低聚糖苷從固定化的植物凝集素親和吸附系統(tǒng)上洗脫專一吸附的糖蛋白目的物。用這類洗脫劑的優(yōu)點還在于它又一次地利用了生物專一性。但這種洗脫方法所得蛋白質溶液往往較稀，并含有可溶性洗脫劑，這可以用透析和凝膠過濾法除去。有些抗原和抗體結合力特別強，上述方法有時尚不能洗脫則可試用鹽酸胍、尿素等蛋白促溶劑作為洗脫劑，洗脫的蛋白在適當處理后能恢復活力者才適用。當分離目的物洗脫下來后可連續(xù)使用大量洗脫液洗滌親和柱，再用平衡緩沖液使親和柱充分平衡，經(jīng)過這樣處理，親和柱就可以重復使用。
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