蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)常見問題原因分析匯總?cè)缦拢?/span>

一、檢測無信號

主要可能由于以下原因?qū)е拢?/span>

1. 用于檢測的二抗不匹配。解決辦法：需要確定一抗的宿主。

2. 一抗二抗的濃度過低：需要耐心地重新實(shí)驗(yàn)。

3.一抗不識別被檢測物種中的蛋白質(zhì)：可以再檢查以下一抗的特異性。

4.凝膠上上樣的蛋白量太少：凝膠上樣品過少也會導(dǎo)致信號弱，所以適當(dāng)增加樣本量也可以防止此現(xiàn)象發(fā)生。

5.傳輸效率相當(dāng)?shù)?/span>：出現(xiàn)這種情況可以嘗試修改轉(zhuǎn)移程序的操作，確保 PVDF 與甲醇預(yù)孵育。轉(zhuǎn)移后干燥 PVDF 以確保蛋白質(zhì)與疏水膜的結(jié)合。

6.一抗使用次數(shù)過多：億康如果過度稀釋對信號檢測也會有一定的影響，所以盡量使用新稀釋的一抗。

7.阻塞時(shí)間過長或洗滌次數(shù)過多：盡量減少阻塞時(shí)間和洗滌時(shí)間。

8. 檢測試劑盒不起作用：這種情況出現(xiàn)的較少，實(shí)驗(yàn)中注意試劑盒的有效期是否正常，也可使用陽性對照并確保檢測試劑盒正常工作。

9.疊氮化鈉可能會抑制二抗：盡量避免在稀釋緩沖液中使用疊氮化鈉。

10.一抗或二抗的孵育時(shí)間太短：可適當(dāng)延長孵化時(shí)間

11. SDS 上樣緩沖液和樣品裂解液沒有充分混合或者混合不均勻： SDS 上樣緩沖液需要隨用隨配，以保證其新鮮度，另外緩沖液與裂解液可以使用渦旋混合器進(jìn)行充分混合。

二、無蛋白質(zhì)的區(qū)域具有高背景

蛋白免疫印跡常見問題中出現(xiàn)這種現(xiàn)象，可能由于以下幾種情況所導(dǎo)致。

1.可能由于封閉時(shí)間過短或封閉緩沖液使用不當(dāng)。大多數(shù)一抗基本不會和白蛋白或酪蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。如果任何沒有蛋白質(zhì)的區(qū)域具有高背景，則封閉步驟可能無法正常工作。

2.一抗或二抗的濃度過高所致：適當(dāng)降低抗體濃度。

3.洗滌不夠充分：可以增加洗滌的次數(shù)。

4.孵化溫度過高：一抗的孵育溫度以4°C左右為宜。

5.轉(zhuǎn)印膜選用不當(dāng)，或者轉(zhuǎn)印膜干燥：一般情況下選用PVDF膜具有較好的轉(zhuǎn)印效果，同時(shí)防止膜干燥。

6.較高分子量的高背景也有可能是由于還原試劑、SDS或樣品加熱方式時(shí)長不正確。

三、出現(xiàn)白帶或信號迅速減弱

1.一抗或二抗過高：適當(dāng)降低抗體濃度

2.ECL 溶液被污染：注意保持ECL 溶液新鮮程度，或者使用新配制的 ECL 溶液。

3.混合后的 ECL 溶液壽命縮短：注意選擇合適的ECL 解決方案。

四、斷帶、特殊條帶出現(xiàn)

凝膠電泳期間使用的電壓過高或緩沖液溫度過高會出現(xiàn)這種情況。

五、出現(xiàn)漫反射帶

1.抗體濃度過高：適當(dāng)降低抗體濃度。

2.凝膠上上樣的蛋白質(zhì)量太高：盡量減少上樣量。

六、出現(xiàn)空白區(qū)域

這種情況多數(shù)是由于轉(zhuǎn)移不均勻所造成。轉(zhuǎn)移時(shí)需要確保膜在凝膠上均勻無氣泡。

七、非特異性信號

有的時(shí)候高濃度的抗體也導(dǎo)致非特異性信號出現(xiàn)。內(nèi)源性免疫球蛋白，尤其是在組織裂解物中 容易出現(xiàn)信號干擾。可以通過預(yù)先清除內(nèi)源性免疫球蛋白來減少來自內(nèi)源性免疫球蛋白的非特異性信號。

八、條帶模糊或者出現(xiàn)污斑

這多數(shù)由于凝膠平衡時(shí)間不足或凝膠與膜接觸不均勻所致。

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