基因測序方法有哪些？當(dāng)今的主要技術(shù)基因測序技術(shù)相對(duì)成熟，DNA測序的主要方法有Sanger 測序、下一代測序 (NGS) 和長讀長測序。以下是對(duì)這些方法、優(yōu)缺點(diǎn)和重要標(biāo)準(zhǔn)的簡要回顧，可幫助您權(quán)衡下一個(gè)測序選擇。

選擇測序方法的標(biāo)準(zhǔn)

選擇測序方法的標(biāo)準(zhǔn)很多，取決于研究人員及其項(xiàng)目的性質(zhì)。正在研究的生物學(xué)問題是關(guān)鍵。Pacific Biosciences 副總裁 Jonas Korlach 說：“研究的背景決定了使用哪種類型的測序，因?yàn)椴煌臏y序方法具有不同的特征來推動(dòng)選擇。”

常見的標(biāo)準(zhǔn)包括測序時(shí)間、通量、成本和準(zhǔn)確度——所有這些往往會(huì)相互影響。“準(zhǔn)確性、成本和數(shù)據(jù)吞吐量之間的動(dòng)態(tài)一直是測序技術(shù)選擇的驅(qū)動(dòng)因素，在不犧牲準(zhǔn)確度的情況下，成本和通量的提高推動(dòng)了 DNA 測序?qū)V泛的應(yīng)用。”

測序?qū)嶒?yàn)室成本主要包括購買儀器費(fèi)用、實(shí)驗(yàn)室試劑耗材費(fèi)用、樣本數(shù)量、計(jì)劃外包測序及測序前的準(zhǔn)備步驟。還有另一個(gè)值得考慮的因素是要測序的目標(biāo)的大小，這會(huì)也影響測序時(shí)間和成本。

測序過程中產(chǎn)生的讀取長度也可能會(huì)影響決策，因?yàn)?/span>其中一些些應(yīng)用需要較長的讀取長度。比如：NGS 產(chǎn)生MIN讀長（約 50-500 bp），其次是 Sanger 測序（約 500-1000 bp），然后是長讀長測序（約 5-30 kb）。

桑格測序

Sanger 測序是一項(xiàng)久經(jīng)考驗(yàn)的技術(shù)，對(duì)于少量樣本來說簡單快速，能夠解析單個(gè)堿基對(duì)。它在摻入放射性標(biāo)記的核苷酸類似物后通過鏈終止起作用。然后通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的 DNA 片段以進(jìn)行鑒定。Sanger 方法對(duì)包含重復(fù)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜 DNA 區(qū)域很有幫助，并且通常被用作驗(yàn)證 NGS 檢測到的遺傳變異的正交方法。

但是，與 NGS 相比，Sanger 測序的通量較低，因此可能不適合大型項(xiàng)目。Sanger 測序可以對(duì)較小的 DNA 區(qū)域、一小組基因以及通常少于 1000 個(gè)樣本進(jìn)行高準(zhǔn)確的測序。

事實(shí)上，對(duì)于較小范圍的項(xiàng)目，使用 Sanger 基因 測序方法進(jìn)行靶向或聚焦測序的項(xiàng)目時(shí)間、成本和復(fù)雜性要低得多，通常使用的是細(xì)管電泳法，即：在毛細(xì)管電泳儀器上的毛細(xì)管內(nèi)使用 Sanger 測序化學(xué)，有助于查明基因片段中的單個(gè)堿基。

新一代測序

測序目標(biāo)的會(huì)嚴(yán)重影響到測序方法的選擇。Sanger 測序適合少量基因或短基因組片段。NGS 測序發(fā)則適合用于 大面積的基因組或全基因組測序。 與使用 Sanger 測序相比，NGS 測序法具有高通量的特點(diǎn)可以使大型項(xiàng)目快速、容易、低成本地進(jìn)行完成測序。所以NGS 是全基因組測序、全外顯子組測序、分析大型基因組、檢測稀有變異以及發(fā)現(xiàn)和診斷的較為理想的選擇。然而，對(duì)于靶向測序，NGS 可能比 Sanger 貴。同時(shí)，NGS 所使用的 NGS 測序儀，儀器成本較高，而且NGS 工作流程比 Sanger 測序更復(fù)雜，

長讀長測序

   在長讀長測序中，DNA 片段在穿過納米孔時(shí)單獨(dú)測序（Oxford Nanopore Technologies），或者在單個(gè)小孔中復(fù)制。較長的重疊序列使組裝更容易，就像用更少的大塊拼圖拼圖，而不是 NGS 中更多的小塊。其他優(yōu)點(diǎn)包括消除了擴(kuò)增偏差，并且可以更容易地檢測到大插入/缺失、重復(fù)區(qū)域等特征。長讀長測序的錯(cuò)誤率可能高于 NGS，但持續(xù)的技術(shù)改進(jìn)正在縮小準(zhǔn)確度的差距。

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