標(biāo)簽：熒光素 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 熒光強度   熒光檢測 啟動子 

螢火蟲可以在螢光素酶的存在下將螢光素轉(zhuǎn)化為氧化螢光素以發(fā)光。利用熒光素酶的較常見的科學(xué)測定是報告基因測定，其中可以通過測量來自熒光素酶反應(yīng)的光信號來跟蹤轉(zhuǎn)錄激活或抑制。建議使用雙熒光素酶系統(tǒng)，其中發(fā)生二次生物發(fā)光反應(yīng)。第二個信號由另一個分子發(fā)出。最常見的是由也可以生物發(fā)光的海腎基因編碼（一些質(zhì)粒已經(jīng)包含海腎和螢光素酶基因，例如 Promega 的 pmirGLO）。這允許您將熒光素酶表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為對照并測量您的相對轉(zhuǎn)染效率。

熒光素酶檢測過程中的注意事項：

1.信號問題：無信號或低信號。

這可能歸于轉(zhuǎn)染問題。我會先檢查你的質(zhì)粒的質(zhì)量。確保您具有轉(zhuǎn)染質(zhì)量的 DNA正常的小量制備柱通常會攜帶更多的內(nèi)毒素和鹽，這些內(nèi)毒素和鹽可能會抑制您的細(xì)胞轉(zhuǎn)染或?qū)е录?xì)胞死亡。

眾所周知，一些細(xì)胞也難以轉(zhuǎn)染。建議對使用的每個細(xì)胞系，對 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的量進(jìn)行滴定實驗。顯然，作為您的標(biāo)準(zhǔn)化對照，使用的海腎質(zhì)粒的量應(yīng)始終保持不變。

2.DNA 量：通常您要評估對照質(zhì)粒與實驗質(zhì)粒，由于添加了實驗序列，這些質(zhì)粒的大小可能不同。即使您將相同量的 DNA 轉(zhuǎn)染到每個孔中，每個孔獲得的 DNA 總量也可能不同，因為您轉(zhuǎn)染的摩爾比不同。

例如：

來自 2000 bp 質(zhì)粒的 1 μg DNA 是 0.76 pmoles DNA

來自 3000 bp 質(zhì)粒的 1 μg DNA 是 0.51 pmoles DNA。

較大的質(zhì)粒每克含有較少的 DNA 摩爾數(shù)！因此，您需要轉(zhuǎn)染更大質(zhì)粒的更多 DNA，才能轉(zhuǎn)染與小質(zhì)粒相同數(shù)量的 DNA。為了使轉(zhuǎn)染的 DNA 量標(biāo)準(zhǔn)化，許多人使用“填充”DNA，例如 pUC19 質(zhì)粒（在哺乳動物細(xì)胞中沒有功能）。

例如，要測試不同數(shù)量的熒光素酶質(zhì)粒但保持總 DNA 相同，您可以執(zhí)行以下操作：

3.時間：您可能錯過了可視化效果的窗口。細(xì)胞通常在轉(zhuǎn)染后 24 – 48 小時進(jìn)行檢測，但這在很大程度上取決于細(xì)胞機器表達(dá)您感興趣的基因所需的時間?？梢砸詢?yōu)化轉(zhuǎn)染后孵育時間的時間過程來決定檢測細(xì)胞的合適時間點。

4.信號太強：飽和度：雖然高的信號可能被視為陽性，但您還需要確保您處于檢測和光度計的動態(tài)范圍內(nèi)，并且不會使信號飽和。如果您有較高的值，則您可能使用了過多的 DNA。

啟動子強度：此外，您可能需要更改質(zhì)粒。如果您使用非常強的啟動子，例如 CMV 或 SV40，這也可能會使您的信號飽和。某些應(yīng)用（例如，如果您正在測量 miRNA 阻斷結(jié)合位點的能力）需要較弱的啟動子，因為您所看到的效果可能比轉(zhuǎn)錄阻遏元件的效果非常輕微。

重復(fù)之間的差異：

同一實驗的孔之間的差異表現(xiàn)在：

1.移液：孔獲得的液體量的微小變化會極大地影響轉(zhuǎn)染和熒光素酶測定的執(zhí)行方式。熒光素酶檢測對此較為敏感！建議為您的轉(zhuǎn)染反應(yīng)制作預(yù)混液（即使它只是用于重復(fù)的 3 個孔）。對于每個組合，您應(yīng)該始終至少有 2 次重復(fù)，最好是 3 次。

2.酶標(biāo)板：另一個問題可能是你的酶標(biāo)板。來自相鄰孔的背景發(fā)光會干擾您的實驗。建議您在白壁或不透明板中進(jìn)行熒光素酶檢測。但是，您無法在白色孔板中看到您的細(xì)胞，因為它們是完全白色的！

3.實驗之間的變異（生物變異）

應(yīng)該重復(fù)多次實驗，以確保您測量的效果是可重復(fù)的，因此有可能與生物學(xué)相關(guān)。然而，我們注意到細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的能力在很大程度上取決于它們的匯合度，尤其是貼壁細(xì)胞。轉(zhuǎn)染依賴于細(xì)胞表面接觸，過度融合的細(xì)胞可能轉(zhuǎn)染效率較低。不要假設(shè)如果您接種相同數(shù)量的細(xì)胞，它們每次都會以相同的方式沉淀在板的底部！從而致使細(xì)胞結(jié)塊。嚴(yán)重地影響您細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和熒光素酶的檢測結(jié)果。

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