17年專注生物實驗室儀器設備&耗材綜合供應
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使用紫外分光光度計進行蛋白質(zhì)的定量的方法有許多，常用的是紫外線吸收法、BCA 方法、Bradford法、雙縮脲方法、 洛瑞 法、WST法等。蛋白質(zhì)定量方法這5種方法對比如下：
表 1. 蛋白質(zhì)定量方法的詳細信息
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原則
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濃度
范圍
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優(yōu)點
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缺點
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紫外線吸收
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280 nm 處的最大吸收對應于酪氨酸和色氨酸的響應，用于分析方法。
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50 至 2000μg/mL (*BSA)
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簡單的方法。樣品測量后即可使用。
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每種蛋白質(zhì)的吸光度不同。無法測量在 280 nm 處沒有吸收的蛋白質(zhì)，如膠原蛋白和明膠。在紫外區(qū)有吸收的核酸污染使測量變得模糊。
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雙縮脲
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多肽鏈與銅離子螯合后，蛋白質(zhì)溶液變成紫色。將包含硫酸銅和羅謝爾鹽的雙縮脲試劑的堿性溶液添加到蛋白質(zhì)溶液中。使用 540 nm 處的最大吸收來確定數(shù)量。
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150 至 9000 μg/mL (BSA)
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簡單的程序。大多數(shù)蛋白質(zhì)的顯色率是恒定的。
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靈敏度低。無法測量蛋白質(zhì)濃度低的樣品。顯色反應受高濃度三氨基甲烷、氨基酸和銨離子的影響。
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洛瑞
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在蛋白質(zhì)溶液中加入堿性銅溶液。蛋白質(zhì)的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸還原苯酚試劑的鉬酸和磷鎢酸，使溶液變藍。使用 750 nm 處的最大吸收來確定數(shù)量。
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5 至 200 微克/微升 (BSA)
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高靈敏度。廣泛使用。
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程序復雜，準備時間長。由于顯色反應是通過還原反應發(fā)生的，因此還原材料的污染會干擾定量測定。每種蛋白質(zhì)的顯色率不同。
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BCA
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BCA 方法結(jié)合了雙縮脲法和二辛可寧酸 (BCA)。BCA 對銅離子具有高靈敏度和選擇性。當通過蛋白質(zhì)的還原作用形成的銅離子與 2 個 BCA 分子反應時，溶液變?yōu)樽仙Ｊ褂?560 nm 處的最大吸收來確定數(shù)量。
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20 至 2000 微克/微升 (BSA)
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簡單的程序。靈敏度高，濃度范圍廣。
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硫醇、磷脂和硫酸銨會干擾測量。
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布拉德福德
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當?shù)鞍踪|(zhì)與三苯甲烷藍顏料之一的考馬斯亮藍 G250 結(jié)合時，蛋白質(zhì)的最大吸收從 465 nm 轉(zhuǎn)移到 600 nm。使用 600 nm 處的最大吸收來確定數(shù)量。
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10 至 2000 克/微升 (BSA)
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非常簡單的操作。幾乎不受阻擋材料的影響。
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每種蛋白質(zhì)的顯色率不同。表面活性劑的污染會干擾顯色反應。
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WST
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用高 pH 值的蛋白質(zhì)還原 WST-8，使樣品變藍。使用 650 nm 處的最大吸收來確定數(shù)量。
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50 至 5000 μg/mL (BSA)
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簡單的方法。幾乎不受表面活性劑的影響。
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每種蛋白質(zhì)的顯色率不同。
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*BSA：牛血清白蛋白
HSA 的吸收光譜
一、紫外分光光度計（比色皿）紫外線吸收法的操作方法：
上圖顯示了人血清白蛋白 (HSA) 的吸收光譜。簡單的紫外吸收分光光度法可以通過使用 280 nm 處的最大吸收來確定樣品中蛋白質(zhì)的數(shù)量。
1. 樣品準備
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牛血清白蛋白 (BSA)：
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0.02, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.4, 0.5, 1, (1.5, 2) 毫克/毫升
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雞蛋溶菌酶：
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0.02, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, (0.4, 0.5) 毫克/毫升
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來自牛胰腺的糜蛋白酶：
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0、0.1、0.2、 0.25 、0.4、0.5 毫克
/ 毫升
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括號內(nèi)的值是用于 10 mm 矩形池的濃度。其他值是用于 10 mm 矩形池和微池的濃度。
2. 測量程序及結(jié)果
測量蛋白質(zhì)溶液在 280 nm 處的吸光度。
表 2. 紫外吸收法的結(jié)果
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蛋白質(zhì) |
細胞 |
濃度范圍 |
校準曲線公式 |
相關函數(shù) |
標準誤差 |
檢測限 |
測定極限 |
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牛血清白蛋白 |
10 毫米矩形電池（石英） |
至 2 毫克/毫升 |
Y = AX + B |
0.9994 |
0.0219 |
0.0097 毫克/毫升 |
0.0470 毫克/毫升 |
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微電池 |
至 1 毫克/毫升 |
Y = AX + B |
0.9999 |
0.002 |
0.0012 毫克/毫升 |
0.0218 毫克/毫升 |
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HEL |
10 毫米矩形電池（石英） |
至 0.5 毫克/毫升 |
Y = AX + B |
0.9991 |
0.0076 |
0.0041 毫克/毫升 |
0.0680 毫克/毫升 |
|
微電池 |
至 0.25 毫克/毫升 |
Y = AX + B |
0.9995 |
0.0031 |
0.0020 毫克/毫升 |
0.0096 毫克/毫升 |
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α-胰凝乳蛋白酶 |
10 毫米矩形電池（石英） |
至 0.5 毫克/毫升 |
Y = AX + B |
0.9997 |
0.0042 |
0.0037 毫克/毫升 |
0.0615 毫克/毫升 |
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微電池 |
至 0.5 毫克/毫升 |
Y = AX + B |
0.9983 |
0.0104 |
0.0091 毫克/毫升 |
0.1263 毫克/毫升 |
二.紫外分光光度計雙縮脲法蛋白質(zhì)測定
1.添加雙縮脲試劑后，蛋白質(zhì)溶液變?yōu)樽仙?，MAX吸收為 540 nm（圖 5）。
2.在 540 nm 吸收處測量顯色反應的時間過程。吸光度大約在 60 分鐘后變得穩(wěn)定（圖 6）。圖 7 顯示了 60 分鐘后測量的 HSA 水溶液的光譜。雙縮脲法通過與樣品反應 60 分鐘后在 540 nm 處的最大吸收來確定數(shù)量。
圖 5.添加雙縮脲試劑后的顏色變化
圖 6.（左）顯色反應的時間過程，圖 7.（右）使用雙縮脲法的 HSA 溶液光譜
3. 顯色試劑準備
雙縮脲試劑：在100 mL水溶液中加入60 mL 10% NaOH，溶解0.3 g CuSO4 和1.2 g羅謝爾鹽，然后加水定容至總體積200 mL。（標準試劑可存放在聚乙烯瓶中。）
4.樣品準備
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牛血清白蛋白 (BSA)：
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0、0.25、0.5、 1 、5、9 mg/mL（
10 mm 矩形池（石英））
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0, 1, 3, 5, 9 mg/mL（微量池）
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雞蛋溶菌酶：
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0、1、3、 5 、9 mg/mL（10 mm 矩形池（石英）、微池）
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來自牛胰腺的糜蛋白酶：
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0、1、3、 5 、9 mg/mL（10 mm 矩形池（石英）、微池）
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5. 測量程序及結(jié)果
將 Biuret 試劑 (2.0 mg) 添加到 500 μL 的蛋白質(zhì)水溶液中并充分混合。然后使溶液反應 60 分鐘。在 540 nm 波長處測量吸光度。
表 3. 雙縮脲法的結(jié)果
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蛋白質(zhì)
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細胞
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濃度范圍
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校準曲線公式
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相關函數(shù)
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標準誤差
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檢測限
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測定極限
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牛血清白蛋白
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10 毫米矩形電池（石英）
|
至 9 毫克/毫升
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Y = AX 2 + BX + C |
1
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0.0109
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0.008 毫克/毫升
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0.1483 毫克/毫升
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|
微電池
|
至 9 毫克/毫升
|
Y = AX 2 + BX + C |
0.9998
|
0.0775
|
0.0696 毫克/毫升
|
1.0127 毫克/毫升
|
|
|
溶菌酶
|
10 毫米矩形電池（石英）
|
至 0.9 毫克/毫升
|
Y = AX 2 + BX + C |
1
|
0.0144
|
0.0133 毫克/毫升
|
0.2420 毫克/毫升
|
|
微電池
|
至 9 毫克/毫升
|
Y = AX 2 + BX + C |
0.9999
|
0.0786
|
0.0640 毫克/毫升
|
--
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|
|
α-胰凝乳蛋白酶
|
10 毫米矩形電池（石英）
|
至 9 毫克/毫升
|
Y = AX 2 + BX + C |
0.9996
|
0.0958
|
0.0934 毫克/毫升
|
1.2987 毫克/毫升
|
|
微電池
|
至 9 毫克/毫升
|
Y = AX 2 + BX + C |
0.9998
|
0.0697
|
0.0695 毫克/毫升
|
0.9987 毫克/毫升
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圖 8.添加苯酚試劑后的顏色變化
三、 洛瑞法蛋白質(zhì)測定
當堿性銅溶液和苯酚試劑添加到蛋白質(zhì)溶液中時，蛋白質(zhì)溶液變成藍色，最大吸收為 750 nm（圖 8）。在 750 nm 吸收處測量顯色反應的時間進程。吸光度在大約 10 分鐘后變得穩(wěn)定。60 分鐘（圖 9）。圖 10 顯示了 60 分鐘后測量的 HSA 水溶液的光譜。
Lowry 方法通過在樣品反應 60 分鐘后使用 750 nm 的MAX 吸收來確定數(shù)量。
圖 9.顯色反應的時間過程軌跡
1.試劑準備：堿性銅溶液：將 50 mL 2% Na2CO3 溶液*3)與 1 mL 0.5% CuSO4 溶液 *4) 混合（只能用于即時分析）。
圖 10. Lowry 法得到的 HSA 水溶液譜圖
苯酚試劑：將市售溶液稀釋至1N。
2.樣品制備
相同的濃度用于 10 mm 矩形池和 10 mm 微池。
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牛血清白蛋白 (BSA)：
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0、2、20、
50 、100、200 μg/mL
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雞蛋溶菌酶：
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0、1、5、
10 、20、50、100 、 200 μg/mL
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來自牛胰腺的α-胰凝乳蛋白酶：
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0、2、20、
50 、100、200 μg/mL
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3.測量程序余結(jié)果
在 500 μL 的蛋白質(zhì)溶液中加入 2.5 mg 堿性銅溶液。充分混合后讓其反應 10 分鐘。然后，加入苯酚試劑。快速混合并讓溶液反應 60 分鐘。測量 750 nm 處的吸光度。
表 4. Lowry 方法的結(jié)果
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蛋白質(zhì) |
細胞 |
濃度范圍 |
校準曲線公式 |
相關函數(shù) |
標準誤差 |
檢測限 |
測定極限 |
|
牛血清白蛋白 |
10 毫米矩形電池（石英） |
至 200 μg/mL |
Y = AX 2 + BX + C |
0.9999 |
1.2336 |
0.8385 微克/毫升 |
3.9441 微克/毫升 |
|
微電池 |
至 200 μg/mL |
Y = AX 2 + BX + C |
0.9994 |
2.5325 |
2.3903 微克/毫升 |
10.1765 微克/毫升 |
|
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溶菌酶 |
10 毫米矩形電池（石英） |
至 200 μg/mL |
Y = AX 2 + BX + C |
0.9998 |
1.3861 |
0.7598 微克/毫升 |
3.5722 微克/毫升 |
|
微電池 |
至 200 μg/mL |
Y = AX 2 + BX + C |
0.9997 |
1.6514 |
0.8911 微克/毫升 |
4.1471 微克/毫升 |
|
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α-胰凝乳蛋白酶 |
10 毫米矩形電池（石英） |
至 200 μg/mL |
Y = AX 2 + BX + C |
1 |
0.685 |
0.4371 微克/毫升 |
7.6764 微克/毫升 |
|
微電池 |
至 200 μg/mL |
Y = AX 2 + BX + C |
0.9999 |
1.3341 |
1.0214 毫克/毫升 |
16.3006 毫克/毫升 |
通過以上實驗結(jié)果參數(shù)對比，可以發(fā)現(xiàn)這幾種蛋白定量分析方法原理都是基于紫外吸收分光光度法的定量方法，所以可以使用簡單的紫外-可見分光光度計進行蛋白質(zhì)定量分析或進行DNA 、RNA濃度測定的常用方法。蘇州阿爾法生物提供的核酸提取儀、紫外分光光度計
、均質(zhì)機、冷凍離心機、超速離心機等實驗室設備，更多內(nèi)容可0512-62956104 咨詢。
蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司成立于2008年，位于蘇州園區(qū)生物納米園（Biobay）A5幢301室。公司管理團隊專注于科學儀器行業(yè)十四年，擁有專業(yè)的技術團隊與完善的售后服務體系，目前已為300余家實驗室提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務，涵蓋各大高校、檢測中心、科研機構(gòu)、制藥企業(yè)等13個群體。提供的實驗室儀器主要包括振蕩培養(yǎng)箱，恒溫恒濕培養(yǎng)箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、PCR儀，瑞寧移液器，生物反應器，發(fā)酵罐，超低溫冰箱，液氮罐，高壓滅菌器，超純水機，天平，離心機，離心濃縮儀、研磨機、葡萄糖乳酸分析儀等。廠商企業(yè)授權包括知楚儀器、朗基、中科美菱，梅特勒，樂楓，搏旅、NEST、天根、奧盛在內(nèi)的80個余廠家。
本文標簽： 紫外分光光度計 蛋白質(zhì)定量 蛋白質(zhì)定量的方法
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