活細(xì)胞成像是使用從幾毫秒到幾小時(shí)的延時(shí)成像來研究活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)生理過程。細(xì)胞成像將多個(gè)快照轉(zhuǎn)換為影像，這與在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢查細(xì)胞活動(dòng)的固定細(xì)胞成像形成對比?；罴?xì)胞成像主要用于研究動(dòng)力學(xué)事件，包括酶活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和膜回收過程。成功的成像依賴于是否達(dá)到活細(xì)胞成像的適宜條件。

對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞成像需要以下條件：

一、培養(yǎng)基選擇

可以使用培養(yǎng)的細(xì)胞系（如 HEK 細(xì)胞和 HeLa 細(xì)胞）和原代細(xì)胞培養(yǎng)物（如皮膚細(xì)胞）進(jìn)行活細(xì)胞成像。您甚至可以使用合適的 掃描成像顯微鏡對活體小鼠或大鼠體內(nèi)的整個(gè)大腦進(jìn)行 成像 。

細(xì)胞生長培養(yǎng)基溶液或基于鹽水的培養(yǎng)基配方，如 DMEM、RPMI 和 Leibovitz L-15等由于不含影響背景熒光的成分被廣泛用于活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。另一方面，鹽水配方有助于緩沖且具有一定的光學(xué)透明度，但不能用于需要高代謝活性的長期研究?；罴?xì)胞成像的適宜 條件：四二、活細(xì)胞成像的 關(guān)鍵因素

1.酸堿度

pH 值對于細(xì)胞系有效生長至關(guān)重要。例如，大多數(shù)細(xì)胞系在 pH 7.2-7.4 時(shí)繁殖最好，成纖維細(xì)胞在 pH 7.7 時(shí)繁殖最好，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在 pH 7 左右時(shí)表現(xiàn)出色。為了跟蹤細(xì)胞生長階段培養(yǎng)基 pH 值的變化，使用酚紅在某些情況下作為 pH 值的指示劑，在 pH 7.4 時(shí)為紅色。酚紅在酸性溶液中變成橙色（pH 7）和黃色（ pH 6.5 ），在堿性溶液中變成粉紅色（ pH 7.6）和紫色（pH 7.8）。然而，活細(xì)胞成像中的常見培養(yǎng)基配方避免使用酚紅，因?yàn)榉蛹t的光吸收消光系數(shù)高，這可能會(huì)導(dǎo)致背景噪聲。

2.緩沖系統(tǒng)

pH 緩沖系統(tǒng)主要包含NAHCO3和二氧化碳。在實(shí)驗(yàn)中，合成的 生物緩沖液可作為短期研究中的緩沖介質(zhì)。比如：HEPES 。當(dāng)細(xì)胞外溶液不能用 HEPES 緩沖時(shí)， CO 2被輸送到系統(tǒng)中，當(dāng)與細(xì)胞外溶液接觸時(shí)，系統(tǒng)會(huì)分解成碳酸氫鹽。這就是為什么顯微鏡上的活細(xì)胞成像通常需要專門為調(diào)節(jié)氣體設(shè)計(jì)的孵化室。通常，濃度為 10-20mM 的 HEPES 緩沖液可以在沒有 CO 2 氣體的情況下控制 pH 值，并提供碳酸氫鈉以實(shí)現(xiàn)適宜生長。

3.氧氣濃度

細(xì)胞系的氧氣需求變化很大。哺乳動(dòng)物細(xì)胞需要氧氣進(jìn)行體內(nèi)呼吸，但在體外作為原代 細(xì)胞生長或永生化后，氧氣通?？梢蕴娲鸁o氧糖酵解。但大多數(shù)活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)不需要嚴(yán)格的氧氣調(diào)節(jié)。所以使用氧氣調(diào)節(jié)策略 通常被用于應(yīng)對 活性氧反應(yīng)可能發(fā)生的光損傷。該策略可能涉及氧氣消耗系統(tǒng)（例如氧化酶）或抗氧化劑（例如維生素 C）以限制自由基損傷。然而，減少的氧氣 在某些情況下，緊張可能會(huì)導(dǎo)致缺氧應(yīng)激，這對細(xì)胞可能是危險(xiǎn)的。

4.滲透壓

大多數(shù)細(xì)胞系在 260 和 320 mosM 之間的廣泛滲透壓值范圍內(nèi)有效生長。通過添加 HEPES 改變體質(zhì)時(shí)，監(jiān)測培養(yǎng)基的滲透壓很重要。大多數(shù)成像室容納的小體積介質(zhì)在介質(zhì)溫度高時(shí)會(huì)由于蒸發(fā)而發(fā)生滲透壓變化。在大多數(shù)情況下，顯微鏡有一個(gè) CO 2控制的孵化室，用于在 37 o C 下處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞。低滲培養(yǎng)基可以在培養(yǎng)皿中常規(guī)更換以補(bǔ)償蒸發(fā)。也可以通過將介質(zhì)密封在帶有油的開放室中或通過控制濕度來最大程度地減少蒸發(fā)。

表 1.哺乳動(dòng)物細(xì)胞活體成像的環(huán)境控制概述。

三、獲得適宜活細(xì)胞成像條件的技巧

在短期研究中使用大量培養(yǎng)基可以避免由于蒸發(fā)而導(dǎo)致的滲透壓和 氧氣的偏差。對于長期研究，可以應(yīng)用加熱單元、加濕孵化室和基于碳酸氫鹽的緩沖系統(tǒng)的組合來控制環(huán)境參數(shù)。

通常先進(jìn)的寬場和共聚焦顯微鏡技術(shù)用于更好地解釋活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果。例如，在相差和微分干涉對比 (DIC) 顯微鏡下觀察細(xì)胞生長和發(fā)育，但有時(shí)更喜歡在立體顯微鏡下觀察發(fā)育胚胎研究。另一方面，熒光技術(shù)用于標(biāo)記特定的細(xì)胞化合物，使它們在共聚焦顯微鏡下更好地觀察。

然而，活細(xì)胞成像系統(tǒng)僅限于某些適宜條件，以確保細(xì)胞保持健康狀態(tài)。總之，活細(xì)胞成像既需要關(guān)注實(shí)驗(yàn)過程中的細(xì)胞功能，又需要應(yīng)用特定的實(shí)驗(yàn)方法。因此，在這些實(shí)驗(yàn)中回顧培養(yǎng)基、環(huán)境控制、pH 值和成像技術(shù)的應(yīng)用非常重要，在這些實(shí)驗(yàn)中，微 小的調(diào)整都可能會(huì)改變細(xì)胞成像的效果。

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