細(xì)胞類型和應(yīng)用不同的細(xì)胞,培養(yǎng)步驟和方法也是不相同的。我們需要注意，如果細(xì)胞培養(yǎng)方法不合適，則細(xì)胞的特性可能會發(fā)生變化。這里介紹的是基本細(xì)胞培養(yǎng)過步驟，特殊的細(xì)胞需要特殊考慮。細(xì)胞培養(yǎng)步驟:

一、細(xì)胞的制備

圖：通用細(xì)胞培養(yǎng)過程的流程圖

獲取細(xì)胞的方法：

一是從細(xì)胞庫或從供體組織中分離細(xì)胞。當(dāng)從細(xì)胞庫獲得的細(xì)胞開始培養(yǎng)時，需要經(jīng)過“解凍”、“細(xì)胞接種”和“細(xì)胞觀察”。

二是通過捐贈者收集。當(dāng)使用從捐贈者那里收集的組織時，如果附著不需要的組織，通常會被移除。

從組織中分離細(xì)胞有兩種主要方法，外植體培養(yǎng)法和酶法。在酶促方法中，使用蛋白水解酶溶液從目標(biāo)組織中分離細(xì)胞。如果使用酶，稀釋酶或用酶反應(yīng)抑制劑終止酶反應(yīng)，然后進(jìn)行“細(xì)胞接種”和“細(xì)胞觀察”準(zhǔn)備  細(xì)胞培養(yǎng)。

二、細(xì)胞解凍

解凍凍存的細(xì)胞來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的步驟也被稱為：“喚醒細(xì)胞”。

細(xì)胞解凍的具體方法如下：

1. 從細(xì)胞庫獲得的一小瓶冷凍細(xì)胞，從液氮罐*1或超低溫冷凍箱（-150℃）轉(zhuǎn)移到合適的冷藏容器，如液氮容器，運(yùn)至工作臺，解凍可置于 37°C 水浴鍋中進(jìn)行。

2. 在冰快融化前，快速加入培養(yǎng)基稀釋冷凍保護(hù)液（EX.DMSO），離心沉淀細(xì)胞，去上清后加入預(yù)熱至37℃的新鮮培養(yǎng)基。然后通過移液將細(xì)胞重新懸浮，并使用顯微鏡或細(xì)胞計數(shù)儀來測量細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞濃度。

細(xì)胞凍存注意事項：

A.在液氮罐中冷凍保存細(xì)胞有兩種方法：使用液氮冷氣的“氣相”和將冷凍保存物直接浸入液氮中的“液相”。在液相的情況下，它可以保存在-196°C，這是液氮的溫度，但液氮進(jìn)入冷凍小瓶并被細(xì)菌、酵母、支原體污染的風(fēng)險很高，和來自其他小瓶的病毒。因此，強(qiáng)烈建議在氣相中儲存。
B. 如果將保存在液相中的小瓶放置在 37°C 水浴或熔化裝置中，小瓶中留有液氮，則小瓶可能會爆裂。在將其放入 37°C 水浴之前，應(yīng)將蓋子松開一次并重新擰緊。

三、細(xì)胞接種和培養(yǎng)：

實現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞接種密度，計算達(dá)到所需的新鮮培養(yǎng)基的量 細(xì)胞接種根據(jù)測量的細(xì)胞數(shù)確定密度，并相應(yīng)地稀釋細(xì)胞懸液。

1.細(xì)胞觀察

將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)容器中后，用光學(xué)顯微鏡或細(xì)胞顯微成像儀觀察：

A.檢查是否有活細(xì)胞

B.檢查以確保細(xì)胞均勻分布在容器中

C.檢查是否存在細(xì)胞以外的異物

D.檢查細(xì)胞形態(tài)，通過檢查細(xì)胞形態(tài)和狀況來確定細(xì)胞類型和培養(yǎng)培養(yǎng)條件，有些情況下需要靜置兩天。

以上確認(rèn)無誤后，將細(xì)胞置于 CO2培養(yǎng)箱中，37°C 開始培養(yǎng)。

2.介質(zhì)更換：

解凍并接種到培養(yǎng)皿中后，細(xì)胞開始 CO2搖床中培養(yǎng). 此時，細(xì)胞會代謝培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，因此必須用新鮮培養(yǎng)基替換已經(jīng)耗盡營養(yǎng)物質(zhì)并富含代謝物的培養(yǎng)基。這個過程稱為“介質(zhì)更換”或“介質(zhì)更換”。

在更換培養(yǎng)基之前，需要觀察細(xì)胞來驗證培養(yǎng)是否正常進(jìn)行。去除舊培養(yǎng)基后，迅速加入新培養(yǎng)基以防止細(xì)胞變干。有些細(xì)胞如果不浸入培養(yǎng)基可能會死亡，所以有些情況下會留下少量舊培養(yǎng)基而不是完全丟棄。此外，應(yīng)將新鮮培養(yǎng)基預(yù)熱至 37°C，以免細(xì)胞暴露于溫度突然變化的環(huán)境中。

更換培養(yǎng)基后，檢查細(xì)胞是否有任何損壞跡象。使用顯微鏡獲取培養(yǎng)物的圖像，以證明其進(jìn)展順利，然后將其送回培養(yǎng)箱，注意盡量減少不必要的干擾。

3. 細(xì)胞傳代培養(yǎng)：

    一旦細(xì)胞開始增殖，在當(dāng)前容器變滿之前將它們分成新的培養(yǎng)容器。這稱為“細(xì)胞傳代”。細(xì)胞生長充滿培養(yǎng)容器的狀態(tài)稱為“匯合”。通常，建議當(dāng)細(xì)胞占據(jù)的面積達(dá)到容器的大約 70% 到 80% 時進(jìn)行細(xì)胞傳代。 當(dāng)它們匯合時，細(xì)胞會相互接觸并感覺它們不再需要生長，這種現(xiàn)象稱為“接觸抑制”，特別是在正常細(xì)胞的情況下，它們在傳代后將不再增殖。如果是癌細(xì)胞的話，它會繼續(xù)快速增殖，容易造成營養(yǎng)缺乏，所以需要實時觀察和監(jiān)測細(xì)胞生長。

四、細(xì)胞傳代培養(yǎng)

懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的傳代方法有所不同。

1.懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：

細(xì)胞培養(yǎng)步驟：收集的細(xì)胞培養(yǎng)懸浮到試管中并離心以收集細(xì)胞。去除上清液，留下細(xì)胞沉淀，并重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中。取部分新鮮懸液，涂上活體染色臺盼藍(lán)，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)。計算細(xì)胞濃度，考慮細(xì)胞稀釋方法，適當(dāng)調(diào)整懸液中細(xì)胞的密度，放入培養(yǎng)瓶中。

2.貼壁細(xì)胞的傳代

粘附在培養(yǎng)容器表面的細(xì)胞需要以某種方式從其表面分離。一般使用膠原酶、分散酶、胰蛋白酶等蛋白酶。在胰蛋白酶的情況下，鈣或鎂離子會抑制活性，因此在使用前必須清洗含 有這些離子的培養(yǎng)基。相反，膠原酶和分散酶在鈣離子存在下表現(xiàn)出活性。

貼壁培養(yǎng)步驟如下：

1.去除舊培養(yǎng)基上清液。如有必要，用磷酸鹽緩沖液或新鮮培養(yǎng)基清洗

2.添加細(xì)胞分散酶溶液。在酶活性范圍內(nèi)的預(yù)定溫度下穩(wěn)定預(yù)定時間以促進(jìn)酶促反應(yīng)。

3.顯微鏡下檢查細(xì)胞脫離程度。

4.通過輕微的機(jī)械干擾，如敲擊等促進(jìn)細(xì)胞脫離。如果酶的終止溶液可用，添加它以終止反應(yīng)。如果不能用，可以添加新鮮培養(yǎng)基以稀釋酶并降低活性，通過多次吸取培養(yǎng)基，將細(xì)胞分離成單細(xì)胞懸液。

5.收集含有細(xì)胞的培養(yǎng)基，離心沉淀細(xì)胞，去除含有酶和反應(yīng)終止液的上清液。

6.向收集的細(xì)胞管中加入新鮮培養(yǎng)基

7.通過上下吹打重懸細(xì)胞

8.取細(xì)胞懸浮液樣品通過細(xì)胞計數(shù)儀或細(xì)胞成像系統(tǒng)來計算細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞密度

9.確定好細(xì)胞密度和細(xì)胞的正確稀釋度，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，并重新懸浮細(xì)胞

將預(yù)定量的細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)容器中。

10.進(jìn)行顯微鏡觀察

11.轉(zhuǎn)移到 CO 2振蕩培養(yǎng)箱中，設(shè)置為 37 °C 的溫度，振蕩培養(yǎng)。

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