單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在通量、成本和功效方面的持續(xù)進(jìn)步使得對(duì)大量單個(gè)細(xì)胞的分析變得可行。現(xiàn)在可以針對(duì)單個(gè)細(xì)胞分析生物學(xué)中心法則的所有關(guān)鍵分子，包括 DNA、RNA（在細(xì)胞和細(xì)胞核中）和蛋白質(zhì)組學(xué)。

單細(xì)胞遺傳信息分析涉及三個(gè)關(guān)鍵步驟：分離或分類、裂解和分析。排序過(guò)程可以使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)行。方法的選擇取決于研究領(lǐng)域和主題。單細(xì)胞測(cè)序的排序方法都依賴于已經(jīng)解離的細(xì)胞；然而，激光顯微切割和玻璃毛細(xì)管等方法也可以從指定的組織區(qū)域收獲細(xì)胞。激光顯微切割具有作為顯微鏡技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，并且允許在分離之前進(jìn)行視覺(jué)細(xì)胞選擇。該技術(shù)在細(xì)胞來(lái)源方面也是通用的，適用于細(xì)胞懸浮液和組織樣本。由熱穩(wěn)定聚合物組成的轉(zhuǎn)移膜與細(xì)胞源接觸放置。用顯微鏡識(shí)別靶細(xì)胞，激光通過(guò)緊鄰的短脈沖“切割”細(xì)胞，激活轉(zhuǎn)移膜，導(dǎo)致粘著斑形成。細(xì)胞粘附后，可以去除薄膜并完成額外的處理。

表 3?；蚪M篩選方法分析。

細(xì)胞分離后，必須獲得感興趣的分子以進(jìn)行進(jìn)一步的下游處理，例如擴(kuò)增。對(duì)于使用微流體方法獲得的細(xì)胞，化學(xué)裂解是常見(jiàn)的方法。裂解試劑選擇的重要原則是確保它不會(huì)干擾目標(biāo)分子或?qū)Ψ糯蠛头治鲭A段的酶或緩沖液產(chǎn)生負(fù)面影響。對(duì)于裂解液的選擇還有一個(gè)因素也要考慮，那就是可能需要特殊的儀器來(lái)確保在操作過(guò)程中不會(huì)丟失微量的樣品。例如，實(shí)驗(yàn)中使用低吸附的移液器吸頭進(jìn)行移液，以避免單細(xì)胞全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序過(guò)程中的 DNA損傷。

單細(xì)胞基因表達(dá)譜的確定依賴于逆轉(zhuǎn)錄酶定量 PCR (RT-qPCR) 和 RNA FISH) 。由于發(fā)現(xiàn)三分之二的基因組轉(zhuǎn)錄為 RNA，但許多轉(zhuǎn)錄本不編碼蛋白質(zhì)。非編碼轉(zhuǎn)錄物被認(rèn)為起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。所以，RNA 的細(xì)胞位置對(duì)基因表達(dá)至關(guān)重要 。在一個(gè)細(xì)胞系的幾個(gè)細(xì)胞區(qū)室中進(jìn)行的研究得出結(jié)論，大多數(shù)剪接是在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中完成的?？紤]到這些因素，單細(xì)胞研究主要側(cè)重于 RNA 檢測(cè)和分析方法，以獲得與之相關(guān)的信息。

單細(xì)胞技術(shù)的不足之處在于：它們將細(xì)胞從其天然細(xì)胞環(huán)境中移除。通過(guò)消除細(xì)胞接觸和相互作用，以及丟失所有空間信息，這些技術(shù)都可能改變細(xì)胞特性甚至丟失有價(jià)值的數(shù)據(jù)參數(shù)。隨著該領(lǐng)域的成熟，這些問(wèn)題正在得到解決。比如：體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組分析 (TIVA) 能夠規(guī)避這個(gè)問(wèn)題。TIVA 采用與細(xì)胞穿透肽相連的可光活化雙鏈寡核苷酸。該系統(tǒng)被稱為“TIVA 標(biāo)簽”，它穿過(guò)細(xì)胞膜，然后失去其肽，從而將其鎖定在細(xì)胞內(nèi)。激光照射揭示了在指定細(xì)胞中捕獲 mRNA 的序列。然后分離和擴(kuò)增細(xì)胞 RNA，以量化整個(gè)細(xì)胞或特定選擇的子隔室的基因表達(dá) 。這項(xiàng)技術(shù)與完整組織中的神經(jīng)元細(xì)胞相比，分離的神經(jīng)元細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量相對(duì)增加。這也證實(shí)了關(guān)于細(xì)胞間相互作用的相關(guān)理論內(nèi)容。

基于液滴的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的另一個(gè)主要問(wèn)題是細(xì)胞雙聯(lián)體的存在。干細(xì)胞是單細(xì)胞遺傳分析的重點(diǎn)領(lǐng)域。識(shí)別基因圖譜的關(guān)鍵差異對(duì)發(fā)育生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)具有潛在的革命性影響。近期的研究表明具有不同遺傳輸出的干細(xì)胞的異質(zhì)性。此外，已經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明基因表達(dá)的差異不會(huì)自動(dòng)預(yù)測(cè)表型表達(dá)的差異。在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中正在收集有關(guān)細(xì)胞命運(yùn)的信息。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在蛋白組學(xué)上的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)研究也在單細(xì)胞水平上進(jìn)行，以確定細(xì)胞的功能差異，并幫助確定擴(kuò)大遺傳探索的關(guān)鍵要素。比如：使用質(zhì)譜法和納米孔技術(shù)比較容易實(shí)現(xiàn)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)篩選，其方法為：將細(xì)胞分散在載玻片上，細(xì)胞核被染色。然后，熒光鏡識(shí)別每個(gè)細(xì)胞的位置，并將坐標(biāo)傳遞給激光器進(jìn)行質(zhì)譜分析。特定基因在單細(xì)胞中的表達(dá)也可以通過(guò)單細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡來(lái)檢測(cè)，例如，使用來(lái)自 ProteinSimple 的 Milo 單細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡來(lái)估計(jì)表達(dá)突觸蛋白的腸內(nèi)分泌細(xì)胞（神經(jīng)足類）的百分比。

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