SDS-PAGE 或十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種根據(jù)分子量分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。是一種廣泛用于法醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、生物技術(shù)和分子生物學(xué)的技術(shù)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率來(lái)分離蛋白質(zhì)分子。

SDS-PAGE原理

SDS-PAGE 的原理表明，帶電分子在置于電場(chǎng)中時(shí)會(huì)以相反的符號(hào)遷移到電極上。帶電分子的分離取決于帶電物質(zhì)的相對(duì)遷移率。

由于電泳過(guò)程中的電阻較小，較小的分子遷移得更快。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和電荷也影響遷移率。十二烷基硫酸鈉和聚丙烯酰胺消除了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和電荷的影響，蛋白質(zhì)根據(jù)多肽鏈的長(zhǎng)度進(jìn)行分離。

SDS 在 SDS-PAGE 中的作用

 SDS 是一種存在于 SDS-PAGE 樣品緩沖液中的去污劑。SDS 與一些還原劑一起用于破壞蛋白質(zhì)的二硫鍵，從而破壞蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

SDS-PAGE 凝膠實(shí)驗(yàn)步驟

一、SDS-PAGE所需的材料

l  電源： 用于將交流電流轉(zhuǎn)換為直流電流。比如：天能的EPS-300，EPS-600等。

l  凝膠： 這些可以選擇在實(shí)驗(yàn)室制備，也可以直接從市場(chǎng)上購(gòu)買的Biofuraw Precast Gel預(yù)制膠。

l  電泳 槽：應(yīng)使用適合 SDS-PAGE 凝膠的電泳槽。比如：垂直電泳槽VE180等。

l  蛋白質(zhì)樣品： 使用 SDS-PAGE 樣品緩沖液稀釋蛋白質(zhì)并煮沸 10 分鐘。還添加還原劑如二硫蘇糖醇或 2-巰基乙醇以還原二硫鍵以防止任何三級(jí)蛋白質(zhì)折疊。

l  運(yùn)行緩沖液： 凝膠上加載的蛋白質(zhì)樣品在 SDS-PAGE 運(yùn)行緩沖液中運(yùn)行。

l  染色和脫色緩沖液：凝膠用考馬斯染色溶液染色。然后用脫色溶液對(duì)凝膠進(jìn)行脫色。然后在肉眼下可見(jiàn)蛋白質(zhì)條帶。

l  蛋白質(zhì)階梯： 參考蛋白質(zhì)階梯用于根據(jù)分子大小確定目標(biāo)蛋白質(zhì)的位置。

二、SDS-PAGE凝膠的制備流程

1.  將除 TEMED 外的所有試劑混合以制備凝膠。

2.  當(dāng)凝膠準(zhǔn)備好倒入時(shí)，添加 TEMED。

3.  將分離凝膠倒入澆注室中。

4.  在聚合之前添加丁醇以去除存在的不需要的氣泡。

5.  梳子插入玻璃板之間的空間中。

6.  聚合凝膠也被稱為“凝膠盒”。

     由于實(shí)驗(yàn)中的SDS-PAGE使用DIY自行配置凝膠，比較耗時(shí)費(fèi)力，目前很多實(shí)驗(yàn)室會(huì)選擇提前配置好的預(yù)制膠，比如采用天能的Biofuraw Precast Bis-Tris Gel 系列預(yù)制膠至少可以節(jié)約1小時(shí)左右的實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

三、樣品制備

(1)  在燒杯中加入純水。

(2)  在樣品緩沖液中加入 2-巰基乙醇。

(3)  將緩沖溶液放入微量離心管中，并向其中加入蛋白質(zhì)樣品。

(4)  將 MW 標(biāo)記放在單獨(dú)的管中。

(5)  將樣品煮沸不到 5 分鐘以使蛋白質(zhì)完全變性。

四、電泳

1.  凝膠盒從澆鑄臺(tái)上取下并放置在電極組件中。

2.  電極組件固定在夾具架上。

3.  將 1x 電泳緩沖液倒入澆鑄框架的開(kāi)口中以填充凝膠孔。

4.  吸取 30ml 的變性樣品在孔中。

5.  然后用蓋子蓋住水箱，并將設(shè)備連接到電源。

6.  將樣品在 30mA 下運(yùn)行約 1 小時(shí)，然后在紫外光下看到這些條帶。 

SDS-PAGE的應(yīng)用

• 可用于測(cè)量分子的分子量。
• 可用于估計(jì)蛋白質(zhì)的大小。
• 可用于比較不同結(jié)構(gòu)的多肽組成。
• 可用于估計(jì)蛋白質(zhì)的純度。
• 可用于蛋白質(zhì)印跡和蛋白質(zhì)泛素化。
• 可用于 HIV 檢測(cè)以分離HIV蛋白。
• 用于分析多肽亞基的大小和數(shù)量。
• 用于分析翻譯后修飾。
• 用于肽圖分析。

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