標(biāo)簽：引物設(shè)計(jì) 定量pcr pcr   ct值 pcr實(shí)驗(yàn)室 

PCR是現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)。PCR技術(shù)主要應(yīng)用于復(fù)制、測序或定量 DNA，簡而言之，PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）是一種利用熱循環(huán)和酶來快速可靠地復(fù)制 DNA 的生化技術(shù)。

在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)前需要做以下準(zhǔn)備：

1. 聚合酶

聚合酶是一種酶，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以從模板 DNA 和核苷酸組裝新的 DNA 鏈。最初的 PCR 反應(yīng)很麻煩，因?yàn)槭?DNA 變性所需的高溫會(huì)殺死聚合酶。

這意味著在每次加熱循環(huán)后，必須手動(dòng)將新的聚合酶添加到反應(yīng)中。然而，在現(xiàn)代 PCR 中，這不是問題，因?yàn)榫酆厦竿ǔ碜詢煞N嗜熱細(xì)菌，即：棲熱菌或者烈性火球菌。

這些聚合酶分別稱為 Taq（發(fā)音為“tack”）和 Pfu（發(fā)音為“PFU”），可以輕松承受與 PCR 相關(guān)的高溫。正常情況下，目前市場上的商業(yè) Taq 和 Pfu 聚合酶已具備速度、保真度、持續(xù)合成能力（完成長讀取的能力）以及讀取富含 GC 的模板的能力。可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求來來選擇不同Taq 酶。

2. 模板 DNA

這是您的聚合酶將讀取和復(fù)制的 DNA。您的模板 DNA 可以是基因組、質(zhì)粒或 cDNA，但無論您的來源如何，質(zhì)量都很重要。模板 DNA 的完整性和純度越高，就越容易獲得良好的 PCR 結(jié)果。此外，請(qǐng)記住，理想的 DNA 量取決于您的來源，但通常每次 PCR 為 1 pg – 1 ng 質(zhì)粒 DNA 或 1 ng – 1 μg 基因組 DNA。

3. 引物

PCR技術(shù)中，引物合成也是重要的一環(huán)。引物是與模板 DNA 結(jié)合的合成 DNA 的短片段。

實(shí)驗(yàn)中通常需要設(shè)計(jì)兩個(gè)引物：一個(gè)“正向”引物和一個(gè)“反向”引物。

您的正向引物指定 PCR 的開始。該引物的序列與您的 5′-3′ 模板 DNA 序列相同。

您的反向引物指定您的 PCR 結(jié)束。該引物的序列是模板 DNA 的反向互補(bǔ)序列。

通常，引物長度為 18-22 個(gè)堿基對(duì)。然而，比它們的長度更重要的是它們的熔化溫度。

引物的熔解溫度應(yīng)為 54–60°C，并且彼此盡可能相似。

有很多在線計(jì)算器可以計(jì)算引物退火溫度，大多數(shù)合成引物的公司都提供此類計(jì)算器。

4. 核苷酸

作為 DNA 的單體，核苷酸是 DNA 復(fù)制所必需的。對(duì)于大多數(shù) DNA PCR，您將使用脫氧核苷三磷酸 (dNTP)。您可以單獨(dú)購買這些產(chǎn)品，也可以將它們作為 dGTP、dCTP、dATP 和 dTTP 混合物購買。

5. 緩沖液：

大多數(shù)商業(yè)聚合酶都提供了理想的緩沖液。這些緩沖液不僅提供正確的 pH 值，而且始終含有鎂、鉀或 DMSO 等添加劑，有助于優(yōu)化 DNA 變性、復(fù)性和聚合酶活性。

6. PCR儀：需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉x擇相對(duì)應(yīng)的PCR儀。近年來，國產(chǎn)的PCR儀市場火熱，很多實(shí)驗(yàn)室中也較為常見，比如：朗基的A300，T20，Q2000C等型號(hào)。

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